...PCR产物电泳图像,大小为1.5kb,但条带上下出现弥散现象,测序波峰出现...

细菌16S rRNA基因序列是集高度保守和变异性与一身的，现在采用的多数PCR扩增引物都是采用的所有细菌的通用引物，即：几乎能够扩增出所有的真细菌。所以，16S rDNA的扩增面临的主要问题是污染，只要有其他细菌DNA的污染，就可能出现假阳性或测序重叠峰，也就是说一条1500bp的带可能是多个细菌的16s rDNA的扩增产物的混合物。
解决这一问题需要注意的事项很多：
1.所有的物品和试剂都要严格防污染，包括taq酶，有很多公司产的聚合酶是用细菌生产的，如果处理纯化不当可能含有细菌的DNA；
2.扩增模板开始时一定要选取单个菌落来制备；
3.由于该基因在多数细菌基因组内是多拷贝的，所以模板DNA的量不宜太多，否则有非特异性扩增（你的带看上去模板DNA就有些过量）
4.测序宜采用连接T载体后进行，不宜采用PCR产物直接测序的方法。
5.每次PCR都要设立未加模板的空白对照！
6.照片中引物二聚体也很多，需适当减少反应体系中引物的用量。

估计细菌不是单一菌株吧？如果不是单一菌株，提高点退火温度，扩出不弥散的条带，割胶纯化后做克隆，挑10至20个测序。如果是单一菌株就只提高退火温度就好了。

1、Smear是非特异扩增的结果。割胶回收回来就好。
2、测序出现非特异：说明你的原始菌体不单一，建议做个克隆后挑几个斑测序。

1、Smear是非特异扩增的结果。割胶回收回来就好。
2、测序出现非特异：说明你的原始菌体不单一，建议做个克隆后挑几个斑测序。

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